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Revista Chilena de Urología

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REVISTA CHILENA DE UROLOGÍA | Volumen 84 | Número 1 año 2019

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TRABAJOS ORIGINALES

Implementación de un modelo de vejiga de rata en cámara de órgano aislado para estudio de la hiperactividad del detrusor

Implementation of a rat bladder model in an isolated organ chamber for study of the hyperactivity of the detrusor

Melissa Cifuentes¹, Javier Palacios², Nwokocha C³, José Luis Vega⁴, Lavado A⁴, Adrián Paredes⁵, Fredi Cifuentes⁴.
1. Unidad de Piso Pélvico, Universidad de Valparaíso y Hospital Carlos Van Buren, Valparaíso, Chile. 2. Instituto de Etnofarmacología, Universidad Arturo Prat, Iquique, Chile. 3. Department of Basic Medical Sciences, Faculty of Medical Sciences, University of the West Indies, Mona Campus, Kingston, Jamaica. 4. Experimental Physiology Laboratory (EPhyL), Antofagasta Institute, Universidad de Antofagasta, Antofagasta, Chile. 5. Laboratorio de Química Biológica, Instituto Antofagasta, Universidad de Antofagasta, Antofagasta, Chile.

RESUMEN

Introducción: La hiperactividad del detrusor correspondería al principal mecanismo fisiopatológico del Síndrome de Vejiga Hiperactiva (SVH). La implementación de un modelo de estudio que permita evaluar el posible efecto de nuevas moléculas en el comportamiento contráctil del detrusor podría contribuir a ampliar las alternativas terapéuticas. El objetivo del presente estudio es describir un procedimiento experimental para la evaluación de la actividad contráctil del detrusor basado en la técnica de miografía la cual permite la obtención de registros de tensión a nivel de vejiga aislada de rata.

Material y Métodos: Se disecan y extraen a través de una laparotomía media, la vejiga de rata hembra de especie Sprague-Dawley. Se secciona la vejiga en 3 anillos de 3 mm cada uno en el plano transversal. Cada anillo se monta en dos soportes triangulares de acero inoxidable; el triángulo inferior está fijo a un soporte de vidrio al fondo del baño y el superior se conecta al transductor de tensión a través de un hilo de seda. Los anillos de vejiga de ratas fueron mantenidos en cámaras para órgano aislado en solución Krebs Ringer a 37°C, burbujeados con 95% O2 y 5% CO2 y fueron estabilizados por 30 minutos sin tensión. Luego se realizó reemplazo de solución y ajuste de tensión inicial a 0,25, 0,5 y 1,0 g por 10 minutos Se registró la tensión desarrollada con transductores de tensión isométrica conectados a unidad de adquisición de datos. La hiperactividad se generó adicionando a los baños Carbacol (1 µM). Se analizó el efecto relajante de Tolterodina, Cloruro de Trospio y Oxibutinina.

Resultados: La adición de KCl 80 mM generó una respuesta contráctil, alcanzando la eficiencia mecánica máxima en la tercera curva. La utilización de los agonistas colinérgicos acetilcolina y carbacol, generaron respuesta contráctil dosis-dependiente siendo carbacol el mejor agente constrictor logrando un efecto sub-máximo en concentración de 10-6 M, comparado con 10-5 M de acetilcolina. En anillos hiperactivos la capacidad relajante de oxibutinina fue de 34 ± 11, 46 ± 11; tolterodina 44 ± 5, 59 ± 8 y trospio 72 ± 11, 83 ± 10 a los 5 y 10 minutos respectivamente. La amplitud de las ondas expresadas como porcentaje y la frecuencia de las ondas expresadas ciclos/minuto, no fueron modificadas. La adición de los vehículos (DMSO 0.1% y aceite de oliva 100%), no produjeron cambios en la hiperactividad.

Conclusiones: El procedimiento experimental descrito permitirá realizar estudios in vitro de los mecanismos involucrados en la hiperactividad del detrusor. Los parámetros descritos reproducen el comportamiento contráctil de la vejiga y responden según lo esperado a moléculas antimuscarínicas utilizadas en la práctica clínica.

ABSTRACT

Introduction: The detrusor overactivity is the main pathophysiological mechanism of Overactive Bladder Syndrome (OAB). The implementation of a study model that allows evaluating the possible effect of new molecules on the detrusor contractile behavior could contribute to extend the therapeutic alternatives. The objective of the present study is to describe an experimental procedure for the evaluation of the detrusor contractile activity based on the myography technique, which allows to obtain records of tension at an isolated level of a rat bladder.

Material and Methods: The Sprague-Dawley female rat bladder is dissected and extracted through a midline laparotomy. The bladder is divided into 3 rings of 3 mm each in the transverse plane. Each ring is mounted on two triangular stainless steel supports; the lower triangle is fixed to a glass support at the bottom of the bath and the upper triangle is connected to the tension transducer through a silk thread. The bladder rings of rats were kept in chambers for isolated organs in a Krebs Ringer solution, at 37 ° C, bubbled with 95% O2 and 5% CO2 and were stabilized for 30 minutes without tension. Then, solution replacement and initial tension adjustment were carried out at 0.25, 0.5 and 1.0 g for 10 minutes. The tension developed with isometric tension transducers connected to the data acquisition unit was recorded. Hyperactivity was generated by adding Carbachol baths (1 μM). The relaxing effect of Tolterodine, Trospium Chloride and Oxybutynin was analyzed.

Results: The addition of 80 mM KCl generated a contractile response, reaching maximum mechanical efficiency at the third curve. The use of the cholinergic agonists acetylcholine and carbachol generated a dose-dependent contractile response, carbachol being the best constrictor agent achieving a sub-maximum effect in a concentration of 10-6 M, compared with 10-5 M acetylcholine. In hyperactive rings, the oxybutynin relaxant capacity was 34 ± 11, 46 ± 11; tolterodine 44 ± 5, 59 ± 8 and trospium 72 ± 11, 83 ± 10 at 5 and 10 minutes respectively. The amplitude of the waves expressed as a percentage and the frequency of the waves expressed in cycles / minute, were not modified. The addition of the vehicles (0.1% DMSO and 100% olive oil) did not produce changes in hyperactivity.

Conclusion: The experimental procedure described will allow in vitro studies of the mechanisms involved in detrusor overactivity. The described parameters reproduce the contractile behavior of the bladder and respond as expected to antimuscarinic molecules used in clinical practice.

INTRODUCCIÓN

El Síndrome de Vejiga Hiperactiva (SVH) es una condición clínica caracterizada por la urgencia miccional o incapacidad de posponer la micción. En la mayoría de los pacientes la urgencia se acompaña de escape involuntario de orina o urge-incontinencia. Otros síntomas frecuentemente presentes son el aumento de la frecuencia miccional diurna y la nocturia.1-3
La real prevalencia de esta patología no se puede establecer con claridad; estudios basados en grandes grupos poblacionales indican que estaría presente entre 7 – 27% de la población masculina y entre 9 – 43% de la población femenina.4-11 La prevalencia de los síntomas de SVH y su severidad tiende a incrementarse con la edad.8-9,12. Cabe destacar el poderoso y negativo impacto que el SVH tiene sobre las personas que lo padecen: gastos elevados, limitación en las actividades cotidianas, depresión, trastornos del sueño, etc. Todo esto se traduce en un deterioro de la calidad de vida.13

La fisiopatología del SVH no está claramente establecida; las principales teorías que explicarían su ocurrencia son: miogénica, neurogénica y autónoma. Independiente de su etiología, la manifestación final sería una contracción involuntaria del detrusor, que no logra ser controlada por los centros inhibitorios15.
Las alternativas terapéuticas más utilizadas en la actualidad corresponden a las modificaciones conductuales, fisioterapia de piso pélvico y uso de fármacos anti-muscarínicos. Si bien las terapias farmacológicas actuales ofrecen aceptables tasas de respuesta en cuanto a mejoría sintomática, suelen ser mal toleradas debido a sus importantes efectos adversos, lo que causa elevadas tasas de abandono del tratamiento14.

Existen múltiples sustancias, incluyendo extractos naturales, que tendrían un potencial efecto a nivel de la musculatura lisa del detrusor y por ende un rol terapéutico para el SVH16. Se requieren modelos que repliquen, con la mayor similitud posible, el comportamiento de la vejiga humana, para avanzar en el camino de ampliar las alternativas terapéuticas de este importante grupo de personas.

El objetivo del presente estudio es describir un procedimiento experimental para la evaluación de la actividad contráctil del detrusor basado en la técnica de miografía la cual permite la obtención de registros de tensión a nivel de vejiga aislada de rata.

MATERIAL Y MÉTODOS

Se disecaron y extrajeron a través de una laparotomía media, la vejiga de 8 ratas hembra de la especie Sprague-Dawley de un peso aproximado de 250-280 g (Fig. 1A). Se secciono cada vejiga en 3 anillos de 3 mm cada uno en el plano transversal (Fig. 1B). Los anillos se montaron en dos soportes triangulares de acero inoxidable; el triángulo inferior se fijó a un soporte de vidrio al fondo del baño y el superior se conectó a un transductor de tensión isométrica a través de una seda (Fig.1C). Los anillos de vejiga de ratas fueron mantenidos en cámaras para órgano aislado de 10 mL, en solución Ringer Krebs pH 7.4, composición mM (120 NaCl, 4.2 KCl, 1.18 KH2PO4, 1.2 MgSO4, 1.3 CaCl2, 5.0 C6H12O6, 25 NaHCO3) a 37°C, burbujeados con 95% O2 y 5% CO2 y fueron estabilizados por 30 minutos sin tensión17. Se registró la tensión con transductores Radnoti XCDR conectados a unidad de adquisición de datos PowerLab 8/30. Para la obtención y análisis de datos se utilizó software LabChart ProV8 ADInstruments (Fig. 1D).

Posteriormente se reemplazó la solución Krebs-Ringer y se ajustó la tensión inicial a 1,0 g por 10 minutos. Se determinó la eficiencia mecánica máxima a través de la estimulación sucesiva con tres dosis de KCl 80 mM a intervalos de 10 minutos y dos lavados con solución Krebs (Fig. 2).

Para evaluar la respuesta contráctil del músculo detrusor a agonistas muscarínicos se usó acetilcolina (ACh) y/o carbacol (CCh) en concentraciones de 10-9 – 10-5 M. Los anillos fueron tensionados a 1 gramo por 10 minutos previo al inicio de la administración de las sustancias. Las dosis sucesivas se adicionaron a intervalos aproximados de 3 minutos o cuando se alcanzó el efecto máximo para la dosis aplicada (Fig. 3).

ESTADÍSTICA

Los resultados son expresados como la media ± error estándar de la media de 2-5 experimentos individuales. La significancia estadística se determinó utilizando análisis de varianza ANOVA de una vía seguido de Test Tuckey para múltiples comparaciones. Se determinó significativo p<0.05.
Resultados
La hiperactividad se generó adicionando a los baños Carbacol en dosis sub-máxima de 1 µM. Los anillos fueron tensionados a 1 gramo por 10 minutos previo a la administración de Carbacol. Se observa inicialmente un aumento rápido de tensión, seguido de una fase de relajación parcial con aparición de actividad fásica. El registro se mantuvo hasta la estabilización de la tensión; entre diez y quince minutos (Fig. 4).

La normalización de la actividad contráctil inducida por carbacol se realizó comparándola con la respuesta máxima generada en la tercera curva de KCl (Fig.5).

Se analizó el efecto relajante de tres agentes antimuscarínicos de uso clínico: Tartrato de Tolterodina, Cloruro de Trospio y Clorhidrato de Oxibutinina en dosis única de 10-8 M. El efecto observado fue una disminución de la tensión máxima (Fig. 6) y de la amplitud, sin modificar la frecuencia de la actividad contráctil (Fig. 7).

Papaverina, fármaco antiespasmódico, también fue utilizado para evaluar la respuesta miorelajante del detrusor (Fig. 8).

Los vehículos utilizados: Dimetilsulfoxido (DMSO 0.1 %) y aceite de oliva (100%), no modificaron los parámetros descritos anteriormente para la actividad de carbacol en el músculo detrusor (Fig. 9)

En base a los resultados presentados, se propone el siguiente protocolo para el estudio de la hiperactividad del músculo detrusor (Tabla. 1).

DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

Los modelos animales son una importante herramienta de investigación para el estudio de las enfermedades; para estudiar las enfermedades urologicas se han utilizado una amplia gama de especies animales tales como raton, cobayo, rata, conejo, cerdo, hámsteres y primates no humanos18. Desafortunadamente, debido a que el SVH corresponde a un syndrome cuyo diagnóstico está basado en síntomas, el desarrollo de un modelo animal específico para esta condición se ve obstaculizado 1, 18. Para ello, nosotros describimos un procedimiento experimental para la evaluación de la actividad contractil del musculo detrusor basada en la técnica de miografía en una vejiga aislada de rata. Este modelo permite la obtención de registros de tension en una vejiga aislada sin el componente regulatorio del sistema nervioso central lo cual permite estudiar mejor los mecanismos celulares a nivel vesical. Este modelo tambien permite evaluar rapidamente la respuesta del tejido a nuevos farmacos.

El procedimiento experimental descrito permitirá realizar estudios in vitro de los mecanismos involucrados en la hiperactividad del detrusor. Los parámetros descritos reproducen el comportamiento contráctil de la vejiga y responden según lo esperado a moléculas antimuscarínicas utilizadas en la práctica clínica.

REFERENCIAS

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